摘要：利什曼原蟲是每年導致 20,000 多人死亡的病原體。在體外篩選 180 萬種化合物確定了 2-氨基苯并咪唑系列對利什曼原蟲的有效活性。斑馬魚胚胎模型的使用可以提高這一比率，為哺乳動物節省開發新藥的時間和成本。 通過優化程序合成了幾種類似物并進行了體外測試，從而得到了一種有前途的2-氨基苯并咪唑衍生化合物（2amnbzl-d），該化合物已用于小鼠體內研究。然而，意想不到的毒性作用阻止了它進入藥物開發臨床前和臨床階段。 由于細胞模型在檢測整個生物體復雜相互作用方面的局限性，為了驗證這一假設，我們使用基于急性毒性、肝毒性、神經毒性和心臟毒性測定的胚胎斑馬魚平臺，將 2amnbzl-d 與兩種已確定安全性的化合物進行了比較：卡馬西平和苯硝唑。測試是雙盲進行的，結果表明存在致死和致畸作用，濃度高于 7.5 μM 時具有肝毒性，暴露于 15 μM 2amnbzl-d 的胚胎出現神經毒性。然而，苯硝唑暴露沒有毒性， 100μM卡馬西平暴露引起心動過緩。使用Pltf-AcHpNrCd與斑馬魚復制了在哺乳動物毒理學試驗中發現的結果，從而減少了部分試驗成本和時間。

背景：細胞培養的體外研究不能很好地預測藥物在整個生物體內的吸收、分布、代謝和排泄（ADME），另一方面，體內研究有助于了解新藥可能的毒性特性，但它們耗時、昂貴且使用的一定數量的動物。斑馬魚胚胎和仔魚的壽命長達120小時，被認為是前所未有的毒理學模型，它展示了多種多樣的生物過程，并擁有完整的脊椎動物器官系統。斑馬魚可以以快速且具有成本效益的方式彌合體外安全性測定和哺乳動物模型之間的差距。由于ARH受體、CYP酶或ADH同功酶等藥物代謝所必需的酶和途徑具有高度的遺傳保守性，因此它也是研究化合物誘導的肝損傷的優秀模式生物，這些酶和途徑在發育的早期就存在并發揮作用。同樣，人類和斑馬魚的心血管生理在解剖、細胞和膜生物學水平上也高度保守，因此許多人類心血管藥物已被證明對斑馬魚仔魚的生理學具有相同的作用，許多人類心血管疾病已經在斑馬魚的遺傳模型中重現。神經活動可通過胚胎神經行為生物標記物進行評估，該標記物與中樞神經系統的神經肌肉功能相關，可指示神經發育的可能變化，如突觸形成和膠質細胞生長。因此，在早期發育階段的胚胎和幼蟲斑馬魚試驗中，可能已經預測了藥物在臨床階段停用和上市后退出的三個主要原因。利什曼病是一種潛在的致命性被忽視的疾病，影響著全世界數百萬人，目前的治療選擇受到治療時間或毒副作用的限制。從通過體外表型篩選鑒定出的一種很有希望的2-氨基苯達唑開始，合成了數百種類似物，目的是找到一種能夠殺死寄生蟲并對人體安全的化合物。在健康小鼠中進行了兩個有希望的先導化合物為期 5 天的耐受性研究。 25 mg/kg/d的劑量耐受性良好，但50 mg/kg/d或以上劑量治療的動物表現出臨床毒性跡象。在利什曼原蟲感染小鼠的后續研究中，結果表明，這兩種化合物均無效，2amnbzl-d先導化合物的安全性較差。本研究的目的是評估Ferreira等人發布的新化學實體2amnbzl-d進行體內研究期間確定的毒性是否可以通過使用斑馬魚模型的試驗進行預測，從而減少測試的時間和成本。

結果：使用OECD指南236對化合物進行的急性毒性試驗表明，暴露于濃度超過25μM的2amnbzl-d的胚胎的致死率與DMSO對照組顯著不同。各濃度的累積死亡率見圖1。96小時的LC50%為14.8μM。對照組沒有死亡，并且在測試期間沒有可能影響結果的事件。 將胚胎暴露于卡馬西平和苯并咪唑化合物進行的測試在任何測試濃度下均未表現出急性毒性。

圖1、與DMSO對照組相比，暴露于各自濃度的卡馬西平（a）、苯并咪唑（b）和2-氨基苯并咪唑衍生物（c）的96 hpf的胚胎和健康胚胎的存活百分比圖。

圖2、劑量-反應曲線顯示了使用每種濃度（6.25,12.5,25,50,100μM）的2-氨基苯并咪唑衍生物處理96小時后死亡或畸形胚胎的百分比。

圖 1 中可以看到由畸形或死亡曲線表示的致畸作用。 在 6.25 和 12.5 μM 的濃度下，胚胎在評估的 96 小時內仍然存活，但大多數暴露于 12.5 μM 的胚胎沒有孵化，呈現蛋黃 囊出血和心動過緩，EC50% 8.57 μM。 另一方面，卡馬西平和苯硝唑在任何測試濃度下均未證明對斑馬魚胚胎發育有致畸作用。為了評估心臟毒性、肝毒性和神經毒性，測試的化合物的最大濃度以先前在 OECD 236 測試中獲得的 LC50% 作為參考。心率數據未顯示對照組 1% DMSO 和 2amnbzl-d 組或苯硝唑組之間的差異。 暴露于 100 μM 卡馬西平的斑馬魚仔魚表現出心動過緩。

圖3、心電圖示例

?圖4、散點圖顯示了心率相對變化的平均值和分布。

關于肝毒性效應，在所有測試濃度下，暴露于化合物卡馬西平和苯硝唑的幼蟲組中未觀察到肝功能的變化。另一方面，在暴露于高于 7.5 μM 的 2amnbzl-d 濃度仔魚組中證實了紅色肝臟顏色的存在和其大小的增加和/或卵黃囊的保留，表明肝臟功能的變化。

圖5、斑馬魚仔魚120 hpf油紅O染色。

圖6、 120 hpf 斑馬魚仔魚暴露于卡馬西平 (a)、苯硝唑 (b) 和衍生的 2-氨基苯并咪唑衍生物（c）的肝毒性百分比。

在暴露于15μM 2MnBZL-d的胚胎組中觀察到神經毒性效應。與1%DMSO對照組相比，暴露于卡馬西平和苯硝唑的胚胎自發運動沒有差異，表明沒有神經毒性作用。

討論：斑馬魚胚胎在不到一周的時間內發育出哺乳動物的大部分主要器官系統，包括心血管系統、神經系統和消化系統，并且大多數安全性和有效性分析可以通過斑馬魚胚胎和幼蟲進行，并獲得與生物學相關的數據。毒理學篩選選擇的試驗使用了120 hpf以下的斑馬魚胚胎和幼蟲，按照國際指令分類為體外模型。2amnbzl-d 化合物在小鼠毒性試驗中顯示出重要的毒理學發現，其藥物研發活動因毒性等原因而停止。為了將獲得的結果與仍處于早期藥物發現階段的新化學實體進行比較，使用了世界衛生組織藥物清單上的兩種核準藥物，苯硝唑和卡馬西平，因為它們的毒理學特征眾所周知?？R西平是局灶性癲癇、神經性疼痛、精神分裂癥和雙相情感障礙的常用處方藥，常見副作用包括惡心和嗜睡，嚴重的副作用可能包括皮疹、骨髓功能下降、自殺念頭或意識模糊。 有腎臟或肝臟問題及懷孕期間的孕婦應慎用。暴露于大劑量卡馬西平的患者中出現心動過緩。苯硝唑是一種用于治療恰加斯病的特效藥，常見的副作用包括皮疹、麻木、發燒、肌肉疼痛、食欲不振和睡眠障礙。懷孕期間或患有嚴重肝臟或腎臟疾病的人不建議使用。

進行了早期體外安全性評估，其中 2amnbzl-d 顯示對 hERG 通道（IC50 > 30 μM）和主要細胞色素 P450 家族酶（IC50 > 20 μM）的低抑制作用，類似地，針對20個標記（涵蓋關鍵人類酶、激酶和受體）中的非靶點小組進行的篩選也顯示出對活性的低干擾（EC50 > 10 μM）。另一方面，2amnbzl-d 化合物在濃度高于 7.5 μM 時顯示出顯著的肝毒性作用，濃度為 15 μM 時在斑馬魚中顯示出神經毒性作用。斑馬魚是脊椎動物，因此與包括人類在內的哺乳動物具有高度的序列和功能同源性（超過 70%）。 由于所有脊椎動物的細胞生物學、發育和代謝過程都是保守的，因此對魚類的研究可以深入了解人類疾病過程，迄今為止所研究的所有蛋白質在魚類和哺乳動物中都具有相似的功能。因此，在斑馬魚和嚙齒動物中證明的2amnbzl-d毒理學效應表明，最初的體外試驗不能很好地預測化合物的毒性。關于心臟毒性作用，2amnbzl-d 對 96 hpf 仔魚的心跳沒有影響，但濃度為 100 μM 的卡馬西平引起心動過緩。 盡管是監管機構批準的藥物，但卡馬西平禁用于有心臟問題的患者，并可能導致一些心臟不良反應，如心臟病、心律失常、房室傳導阻滯伴暈厥、心動過緩、充血性心力衰竭、冠心病惡化。

結論：由于毒性試驗中發現了顯著變化，2amnbzl-d在濃度高于4μM時可能會引起與死亡或畸形、肝毒性和神經毒性相關的急性毒性作用。目前的研究表明，2amnbzl-d化合物的毒性可以通過斑馬魚模型在短短5天的評估中預測，并在隨后的試驗中改進哺乳動物的使用。

原文出自：Zebrafish toxicological screening could aid Leishmaniosis drug discovery | SpringerLink